钙成像技术使得原本悄无声息的神经活动变成了一幅斑斓闪烁的壮观影像,科学家终于可以亲眼看着神经信号在神经网络之中往来穿梭。

钙成像技术(calcium imaging)是指利用钙离子指示剂监测组织内钙离子浓度的方法。在神经系统研究方面,钙成像技术广泛应用于检测神经元的活动情况。钙成像技术在神经科学、生理与药理研究、疾病模型研究和新药筛选与开发等领域具有广阔的应用前景,能够帮助科学家深入了解细胞内的生理和病理过程。

钙成像原理

在哺乳动物的神经系统中,钙信号与神经细胞的兴奋性、细胞通讯、递质释放、突触可塑性以及基因转录等诸多生理、病理过程相关。

当神经元膜电位发生去极化,产生的动作电位传导到神经元轴突末梢时,细胞膜上的电压门控钙离子通道打开,大量钙离子内流,包含神经递质的囊泡由突触前膜释放至后膜,下游神经元就得以接受到上游的信号。钙离子浓度可以表征突触传递和神经元活动。神经元钙成像技术的原理就是借助钙离子浓度与神经元活动之间的严格对应关系,利用特殊的荧光染料或者蛋白质荧光探针(钙离子指示剂,calcium indicator),将神经元中的钙离子浓度通过荧光强度表现出来,从而达到监测神经元活动的目的。

钙成像技术应用

1. 记录培养的神经元的活动。

2. 记录脑片上神经元的活动。

3. 活的记录神经元的活动。由于离体实验本身的限制,现在越来越多的神经科学家倾向于做活的钙成像实验,希望能得到更准确且更能反应生理状况的数据。得益于在体荧光显微镜的发展,现在,在实验动物处于活的状态下进行钙成像记录的技术取得了飞速进展。

4. 活的记录神经元树突和树突棘(spine)的活动。由于对实验精度的要求,有些科学家不  想记录单个神经元的反应,他们还想更精确地知道神经元上哪些树突和树突棘参与了某个行为,也就是说他们需要在活的条件下,对单根树突以及树突上spine进行钙成像记录实验。由于双光子荧光显微镜和GCaMP6基因编码钙离子指示剂的发展,现在,对树突和树突棘用钙成像实验进行记录也成为了可能。

实验准备

实验对象

(1)GCaMP或WT小鼠

(2)大鼠

设备

(1)脑立体定位仪

(2)Inscopix在体自由活动神经元成像系统

(3)异氟烷麻醉系统

(4)体温维持仪和恒温垫

(5)手术工具,包括眼科剪、精细镊、胰岛素注射器

(6)颅钻、0.5mm(或0.6mm、0.8mm、1.0mm)钻头

 材料和试剂

(1)Inscopix Lens

(2)镜头湿巾

(3)棉签

(4)Metabond骨胶

(5)Kwik-Sil生物硅胶

(6)红霉素眼膏

(7)生理盐水

(8)酒精

(9)碘伏

(10)冰

实验步骤

一、优化病毒

首先通过组织学检查评估特定病毒 GCaMP 指示剂(此过程可能需要多次稀释)的优化效果。

二、注射病毒

注射病毒到感兴趣的脑区在特定的细胞上表达GCaMP。

三、 埋置透镜

埋植到表达了 GCaMP6 的细胞区域,用来连接微型显微镜。

(1)将动物固定到立体定位仪上,准备颅骨进行手术(去掉组织/血液并平整颅骨)。

① 动物预麻醉后,通过耳杆和上齿固定办固定于立体定位仪上

② 减去头部的毛

③将红霉素眼膏涂抹到小鼠眼睛上

④使用碘伏和75%酒精进行头部皮肤的消毒

⑤沿矢状缝作切口,剥离筋膜及肌肉,推开骨膜,用干棉球擦拭,暴露骨缝,止血。

⑥使用手术刀或颅钻对颅骨进行粗糙处理。

⑦通过前囟和后囟,以及前囟旁开位置(如图中±2.0mm)进行颅骨调平。前囟和后囟的DV<50um。前囟旁开位置的DV<50um。

(2)在定位仪上准备定位针并调整头骨

① 准备ProView植入套件,30G钝针,V形夹

② 组装ProView植入套件,并将30G钝针夹持到底座支架上

③ 将ProView植入套件固定到立体定位仪上

④ 将30G钝针定位到前囟点

⑤ 定位成像位置

(3)GRIN Lens植入

①使用颅钻在成像位置进行开颅

②通过ProView植入套件将Lens植入到目标区域位置。

备注:植入Lens的方法取决于Lens的规格和大脑区域,具体操作教程可关注公众号,即将更新发布,敬请期待。

四、连接并成像

对神经元进行成像并记录数周甚至几个月的数据。当神经元细胞刺激后,胞内钙(Ca2+)水平增加,GCaMP 与钙离子结合并产生瞬时荧光信号。

五、处理数据

将钙离子信号通过数据采集主机(DAQ)传输到电脑上。使用 Inscopix Data Processing 数据处理软件处理钙成像视频,提取细胞、波形和事件。

附件:大脑区域参考表

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